作業加筆記
筆記: 1.作筆記看不如說,說不如寫
2. google快訊
3.許多的搜尋資料庫 ex:華藝
4.台灣博碩士論文系統
5.學習從模仿開始
前
言
歐洲鰻皰疹病毒 (European eel Herpesvirus, EEHV) 在台灣循環水養殖系
統中分離出來造成了本島鰻魚極高的死亡率(Chang et al., 2002)。 於荷蘭採
用相同飼養模式所採樣之病鰻也分離出歐洲鰻皰疹病毒 (Davidse et al.,
1999) 。由台灣歐洲鰻分離出來的皰疹病毒去氧核糖核酸聚合? 片段 (Pol) 與
歐洲鰻皰疹病毒相似度達 99% (298/300) (Chang et al., 2002)。病毒主要特
性為持續性無臨床症狀的潛伏感染，於當內(internal factor)、外(external
factor)在因子造免疫力下降時則發病 (Davidse et al., 1999)。電子顯微鏡下
病毒的核蛋白衣 (nucleocapsids) 直徑大小約 100nm。成熟的病毒顆粒直徑大
小約 235 nm，其內並含有一個外面包含粗糙外膜 (capsule) 的六角形核蛋白衣
(nucleocapsid) 之電子緻密核心。組織病理學檢查於皮膚的上皮細胞中發現代
謝性包含體 (metabolic inclusion bodies)及內臟器官中有黑色素巨噬細胞
(melanomacrophages)聚集 (Chang et al., 2002)。
在台灣，大部分的歐洲鰻以循環水養殖系統超集約飼養，主要是因為可以節
省大量的養殖用水以提高鰻魚的產值。然而，感染歐洲鰻? 疹病毒的鰻魚一旦發
病沒有有效的治療方式；目前也無疫苗可以應用於臨床控制。因此，針對病毒的
特性建立一個適當的環境控制是非常重要的。本實驗旨在了解歐洲鰻? 疹病毒的
物理、化學特性及在緊迫因子之下病毒潛伏感染發病的情形；希望可以對歐洲鰻
養殖業者有些助益。
1
第
一
章
文 獻 回 顧
2
1. 皰疹病毒簡介
皰疹病毒科病毒存在於生物界多種生物體中；包含昆蟲、爬蟲類、兩棲
類、哺乳類及魚類；為一具有雙股去氧核糖核酸 (DNA) 及封套(envelope)
之病毒。病毒顆粒大小約 120-200 nm ，呈圓球形， 其外殼 （capsid） 由
162 個次蛋白衣（capsomer）組成，呈 20 面體結構。 核蛋白衣直徑約
100-110nm ，次蛋白衣呈球中空的三角形或五角形的管子為此病毒特徵性之
構造 (Fenner et al., 1999)。
皰疹病毒在基因上有 3 種明顯的特色包含：G+C 的比率為 32-74﹪之間，
遠遠超過其他 DNA 的真核生物。基因變化大小主要在 125-235 kbp。病毒基
因組成複雜，如反覆的 DNA 片端出現在兩端。另外，皰疹病毒的非構造性蛋
白與病毒本身及寄主細胞間的生長及免疫調控有關，可以使病毒在細胞中繁
殖時不會立刻殺死細胞，而將複製時間延長。皰疹病毒的潛伏感染基因目前
是認為位於寄主細胞染色體外(extrachomosomal)的游離體基因(episome)中
(Frederick A. et al., 1999)。
Roizman et al.(1981)將皰疹病毒由生物的特性來分類， Alpfa-、
Beta-、Gamma-herpesvirinae 三個亞科(subfamily)，Honess(1984)更進一
步細分出這三種亞科的基因體大小、結構、(G+C)比率(Roizman et al.,
1981 ； Boblot et al., 1992) 。 而 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 屬 於 皰 疹 病 毒 科
3
(Herpesviridae)尚未分類之亞科(unclassified)。
2. 皰疹病毒複製方面
Beta-及 Gamma-皰疹病毒複製的機制大部分是相同的但複製的速度較
Alpfa-皰疹病毒慢。當病毒的醣蛋白膜粒（glycoprotein peplomers ）與寄
主細胞上的接受器（receptor）結合時，病毒的核蛋白衣藉著病毒的封套與
寄主細胞膜的融合（fusion）或是胞飲作用（ endocytosis）進入寄主細胞中。
之後病毒的 DNA 蛋白複合物由核蛋白衣釋放出來並進入寄主細胞的細胞核中
(Fenner et al., 1999) 。 病 毒 成 熟 的 過 程 包 含 病 毒 完 整 的 DNA 內 衣
（endocapsidation）進入核蛋白衣內，而後病毒顆粒聚集成空泡進入細胞質
內，釋放藉著胞吐作用（exocytosis） 或細胞溶解作用（cytolysis）釋出
寄主細胞。在寄主細胞膜上的病毒特異性蛋白在細胞融合中扮演著如 Fc
receptors 的角色，並且被認為是引起免疫細胞融合的主要標地 (Fenner et
al., 1999) 。 病 毒 造 成 寄 主 細 胞 內 產 生 的 核 內 包 涵 體 （ Intranuclear
inclusion bodies）為皰疹病毒的主要特色，通常可以在適當固定及染色的
組織中發現以及由被皰疹病毒感染的動物細胞培養中發現(Fenner et al.
1999)。
3. 皰疹病毒潛伏性感染
皰疹病毒是無法在寄主體外生存良好的強依賴性病毒，一般主要由發病
4
動物的黏液傳播，如交配、互舔的動作、打噴嚏的飛沫、經母體傳至子代的
垂直傳染和幼畜之間互相的水平感染等，在大型密集飼養的族群中如牛場、
豬場及煮肉的工廠，打噴嚏及短距離的飛沫為主要的傳然途徑。而其主要藉
由持續性的潛伏感染及週期性的再發生和散發存在於族群的世代之間；皰疹
病毒是非常專一性的病毒，主要是因為在寄主身上的潛伏性感染造成與寄主
同時演化的結果，病毒只能在專一寄主上生存。潛伏性感染的特色使得皰疹
病毒可以永存在生物體上，即使是很小的孤立組群(Frederick A. et al.,
1999)。
週期性復發或是持續性的潛伏感染(Persistent infection)是皰疹病毒
的特性之一，從分類的角度上來看潛伏感染；Alfa-皰疹病毒感染生物體後為
了躲避寄主細胞的免疫系統攻擊會躲藏在寄主神經系統掌控感覺的神經節當
中，Beta-皰疹病毒則是躲藏在寄主的分泌腺、淋巴網狀內皮細胞的組織以及
腎臟當中；Gama-皰疹病毒則是主要躲藏於淋巴組織當中。少部分的 Beta 及
Gama-皰疹病毒潛伏於皮膚表面的上皮細胞中。在潛伏感染狀態下 (Latent
infection)，此時感染動物沒有任何臨床症狀，也分離不到具感染能力的病
毒(Rziha et al., 1986)。
經過多次複製的病毒 DNA 或形成游離基因或少部分與寄主之神經元細胞
染色體 DNA 合併造成潛伏感染。潛伏感染的皰疹病毒基因是不被轉錄的除非
外來因子激起了潛伏感染有關之轉錄體(Latently-associated transcript,
5
LATs)(Fenner et al., 1999)。病毒的轉錄 RNA 在複製的過程中並不會形成
蛋白質；其只要的功能在於建立、維持以及再活化潛伏感染之病毒，主要促
使再活化機制的因子至今尚未完全了解。激起潛伏感染再活化的因子主要是
緊迫，包含了合併感染、運輸以及擁擠或是高密度的飼養環境(Fenner et al.,
1999, Frederick A. et al., 1999)。
4. 在歐洲鰻皰疹病毒方面
而在歐洲鰻皰疹病毒方面 Van Nieuwstadt et al.(2001)則證實了在臨
床上是健康或是發病的歐洲鰻即使身上有特異性抗體的存在，潛伏感染的情
形也同樣存在。歐洲鰻皰疹病毒潛伏性感染的位置，Chang et al. (2002)
以原位雜交法(In situ hybridization, ISH) 在外觀無病灶的歐洲鰻的皮
膚、肝、脾和腎檢測出黑色素巨噬細胞內含有歐洲鰻皰疹病毒之核酸，證明
了被活化的皰疹病毒會出現於組織器官中中，但是原本病毒躲藏的位置目前
尚不清楚。而歐洲鰻感染皰疹病毒的方式可能是病魚排毒至水中時，健康鰻
經由鰓接觸病毒而感染，或由母鰻經排卵或排卵過程污染而傳至子代。具有
潛伏感染的歐洲鰻受到緊迫時排毒的路徑目前為止仍然不清楚
(Haenen,O.L.M. et al., 2002）。
6
5. 皰疹病毒魚類宿主範圍
最 早 的 文 獻 記 載 為 Perciformes 目 Percidae 科 之 大 眼 魚
(Walleye)(Kelly et al., 1931)之後，斑點叉鯰魚(Channel catfish)(Wolf
and Heman , 1971)、紅鮭魚(Sockeye salmon)(Sano et al., 1976)、紅鱒
魚(Rainbow trout) (Wolf et al., 1978)、刺鯧(Psetta maximal)(Buchanan
et al., 1978)、白斑狗魚(Northern pike) (Yamamoto. 1984)、鯉魚(Common
carp)(Sano et al. ,1985)、大星鯊(Smooth dogfish)(Leibovitz et al.,
1985)、銀大麻哈鮭魚(Coho salmon)(Horiuchi et al., 1989)、湖鱒(Lake
trout)(Bradley et al., 1989)、白鱘(White sturgeon)(Hedrick et al.,
1991)、日本鰻魚(Japanese eel)(Ueno et al., 1992)及歐洲鰻魚(European
eel)(Davidse et al., 1999)均有相關報告。
6. 歐洲鰻之簡介
歐洲鰻，英文名為 European eel 屬於硬骨魚類，學名為 Anguilla
anguilla ， 在 分 類 上 屬 於 Actinopterygii 綱 ， Anguilliformes 目 及
Anguillidae 科 (Stoskopf. 1993)。他們是闊頭及海移棲淡水河產卵的物種
(euryhaline and anadromous species)。年輕的鰻魚於淡水中成長，雄性的
鰻魚在於淡水生活 6 至 12 年，雌性的鰻魚則是 9 至 20 年；當生長期結束鰻
7
魚達性成熟之後他們就遷移至海洋中，居住於深海底部。成鰻在遷移時不進
食，配子形成(Gametogenesis)主要發生於接近馬尾藻海洋(Sargasso Sea)
其為北大西洋一海域，在西印度群島與亞速群島之間，有大量海藻漂浮其平
靜海面。產卵時間於晚東及春天時。經卵孵化後之狹首型幼鰻(Leptocephali)
隨著墨西哥灣流到達歐洲沿海，由卵的孵化地至歐洲沿海最長可達 3 年的時
間；在到達沿海的入河口時，狹首型幼鰻會轉變成幼鰻(Elver)。在進入淡水
河流域時幼鰻會加速成熟以適應河水中的溫度。(Stoskopf,1993)。成鰻主要
分部於北大西洋、波羅海、地中海、亞洲南部及美國中部的海域；在歐洲沿
海的黑海(Black sea)至白海(White sea)之間也是他們生長的地區(Stoskopf.
1993)。
7. 鰻魚皰疹病毒之回顧
1985 年 ， 鰻 魚 皰 疹 病 毒 (Herpesvirus anguillae)在 亞 洲 由 日 本 鰻
(Anguilla japonica)及歐洲鰻(Anguilla
anguilla)首次分離出來 (Sano
et al., 1990)，發病的鰻魚在皮膚及肝臟上分別出現紅斑及壞死等病灶，死
亡率約為 1%至 6.8%。Kobayashi et al. (1997) 首次的描述皰疹病毒在日本
鰻的皮膚上形成嚴重的病灶。Ueno et al. (1996) 藉著細胞融合的發生，交
叉反應中和抗體力價實驗 (cross reactivity in neutralization tests)
及 構 造 性 蛋 白 的 電 泳 結 果 (electrophoretic patterns of structural
8
proteins)證明了日本鰻感染了皰疹病毒。 Lee et al. (1999) 描述了被皰
疹病毒感染的日本鰻鰓絲壞死之情形。Bekesi et al. (1986) 證明發生在匈
牙利歐洲鰻皮膚病灶上的病毒是皰疹病毒，但尚無法被分離出來。Jorgensen
et al. （1994）在法國由無發病的歐洲鰻上分離出皰疹病毒。 Davidse et al.
(1999) 首次在荷蘭飼養於循環水養殖系統中的歐洲病鰻分離出皰疹病毒；自
1996 年起，由爆發疾病的歐洲病鰻分離出來的各臟器中經由電子顯微鏡檢查
的結果均可發現皰疹病毒的存在。 Van Nieuwstadt et al. (2001) 證實了
歐洲鰻皰疹病毒具有潛伏性的感染，並且可以因為外在因子如溫度、飼養密
度、水質等改變造成的緊迫而導致發病。
8. 台灣鰻魚飼養之近況
鰻魚主要養殖在嘉義縣、彰化縣、雲林縣、台南縣、屏東縣及高雄縣，
以集約飼養為主(Chen. 1998)；台灣鰻魚養殖可以分成四個階段 由 1923∼
57 的發展期，1958∼69 萌芽期，1970∼78 成長期，及 1979∼90 繁榮與調整
期至今的衰退期；1991 年起，鰻魚養殖產業進入不景氣階段，產量從 1991
年約 5 萬 6 千噸衰退至 1996 年不到一半的 2 萬 5 千噸，平均生產力從 1991
年的每公頃 14.8 噸降至 1996 年的 6.8 噸 (Chen. 1998)。主要的原因是因為
中國的鰻魚養殖產業有較多的優勢，像日本鰻苗來源充足、優質水源豐沛、
人工成本低以及從台灣及日本轉移過去的現代科技等使得台灣的鰻魚養殖一
9
厥不振 (Chen. 1998)。
1990 至 1992 之間，日本超過 50%的鰻魚是由台灣出口，為解決鰻苗短
缺以及增加鰻魚產值，台灣省水產試驗所在 1991 年引進丹麥的超集約循環水
養鰻系統，並應用於歐洲鰻之飼養中。這種系統的優點主要可以節省大量的
用水以避免過度抽取地下水造成的地層下陷的問題及增加鰻魚的產值 (Chen.
1998, Shi. 1999)。
台灣的歐洲鰻苗主要經由法國及英國進口而來，平均一年 1 至 2 次。台
灣的歐洲鰻大都飼養於循環水系統中，經過 1 至 2 年的飼養後移至室外池繼
續飼養半年；而後大部分的鰻魚均輸出海外，70%.輸出至日本，20%輸出至韓
國剩下的 10%則內銷(Chen. 1998, Shi. 1999)。
9. 實驗目的
近年來無論是台灣或者是歐洲的歐洲鰻養殖業者均致力尋找一個有效的
方式來預防或是治療皰疹病毒，但是由於病毒潛伏感染的特性使得帶毒鰻魚
外觀並無異樣，使得預防非常困難；而當發病時則難以控制；目前並無疫苗
可以應用於臨床，所以本實驗之目的希望進一步了解歐洲鰻皰疹病毒物理化
學之基本特性，希望可以應用外在因子的控制方式，來降低病毒的發生率已
達到減少發病時漁民的損失。
10
第
二
章
材 料 與 方 法
11
1.
歐洲鰻皰疹病毒之分離
歐洲鰻皰疹病毒之分離方式參照 潘毅豪,(2001)之方法進行。
2.
細胞
吳郭魚的卵巢細胞(TO2)為本實驗主要應用之細胞株，以細胞培養液
(Eagle’s minimum essential medium, MEM, HyClone, Denmark)加 10
﹪胎牛血清(Fetal Bovine serum, FBS, HyClone, Denmark)培養成單層
細胞後備用(潘, 2001)。
3.
歐洲鰻皰疹病毒之準備
皰疹病毒之來源為由 2001 年在台灣北部發病之歐洲鰻分離而來(Pan,
2001) 首先，將病毒以 0.1 至 0.01 感染複數(Multiplicity of infection,。
MOI)接種至 TO2 細胞株上，待其細胞病變(CPE)完全後，將病毒及血清培
養液收集起來並儲存至-60℃中備用(潘, 2001)。病毒力價 TCID50/ml(The
50﹪tissue culture infectious dose)之計算方法參考 Reed and Muench
(1938)發表的算法。
4.
歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性(Cell Line Specificity)
利用 9 株細胞來測定歐洲鰻皰疹病毒是否會對不同細胞造成細胞病
變。實驗之細胞株包含：鰻魚的表皮細胞(EE)、鰻魚的卵巢細胞(EO)、鯉
魚的乳頭上皮細胞(EPC)、鰻魚的上皮細胞(EP1)、大翻車魚細胞(BF2)、
12
虹鱒魚細胞(RTG)、大臉? 魚細胞(FHM)、吳郭魚的卵巢細胞(TO2)及契奴
克魚胚胎細胞(CHSE)。
將各細胞株培養於含有 10﹪胎牛血清的細胞培養液中，並事先於培
養 液 中 加 入 50IU/mL 的 青 黴 素 (penicillin) 及 50mg/ml 的 鏈 黴 素
(streptomycin)；除了 CHSE 及 RTG 放置於 20℃恆溫培養箱外，其餘細胞
均放置於 28℃恆溫培養箱中培養三天。待細胞長滿於 25 cm 的培養瓶
(Flask, NUNC, Denmark)後將 100 ml，病毒力價 10
8.0
2
TCID50/ml 之皰疹病
毒接種(Inoculated)於各細胞株上；感染 30 分鐘，並於每 5 分鐘輕輕搖
晃數次以增加病毒與細胞接觸的機會。然後將接種之病毒液倒出並用 PBS
沖洗 2 次後，加入含有 2﹪胎牛血清的細胞培養液後進行觀察是否有細胞
病變發生 (Davides et al., 1999). 。
5.
歐洲鰻皰疹病毒物理、化學特性
1. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 最 適 生 長 溫 度 之 測 定 (Optimal temperature
determination)
將病毒如前述接種入培養於於 25cm2 培養瓶的 TO2 細胞株上後分
別放入 18、20、24、26、28 和 30℃恆溫培養箱中進行培養。四天後
將病毒及血清培養液收集起來並進行病毒力價之測定 (Eaton et al.,
13
1992, Winton et al., 1985)。
2. 歐洲鰻皰疹病毒對溫度的容忍性之測定(Tolerance of temperature)
將含 1ml 的病毒液(病毒力價 10
8.0
TCID50/ml)之試管分別放置於
18、37 和 56℃恆溫培養箱中，待 30 分鐘後接種於已培養 3 天 TO2
細胞之 96 孔盤上(96-wells plate, Corning, Austria)進行病毒力
價之測定 (Winton et al., 1985)。
3. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 對 酸 鹼 的 穩 定 性 之 測 定 (pH stability
determination)
將 EMEM 分別調成 pH 3、5、7、9 和 11 再分別取 4ml 放入試管中；
之後個別加入 1ml 的病毒液（病毒力價 108.0 TCID50/ml）並放置於 28℃
恆溫培養箱中，30 分鐘後接種 96 孔盤上進行病毒力價之測定 (Winton
et al., 1985, Eaton et al., 1992)。
4. 歐洲鰻皰疹病毒對氯仿(Chloroform)敏感性之測定
根據 Feldman and Wang (1961)，首先將 1mL Chloroform 加入 2ml
的病毒液(病毒力價 108.0 TCID50/ml)試管中，震動 15 分鐘後於 4℃以
2000xg 離心 10 分鐘後將病毒接種於 25 cm2 培養瓶的 TO2 細胞株上；
14
放置於 28℃恆溫培養箱中；7 天之後進行病毒力價之測定。另設一實
驗組，將病毒液的部份以 MEM 代替，其他部分均相同。(Eaton et al.,
1992, Winton et al., 1985, Kasornchandra et al., 1997)。
5. 歐洲鰻皰疹病毒對 IUdR 敏感性之測定
把 50mg 的 IudR(5-iodo-2'-deoxyuridine)及 2ml 的病毒液(病
毒力價 10
8.0
TCID50/mL)放入試管中混合均勻，再接種至 TO2 細胞株中
放置於 28℃恆溫培養箱中，7 天後測定病毒力價之改變。實驗組則將
病毒液的部份以 MEM 代替，其他部分均相同。 (Kuchler et al.,1977,
Winton et al., 1985, Kasornchandra et al., 1997)。
6. 歐洲鰻皰疹病毒對乙醚(Ether)敏感性之測定
將 0.2ml Ether 及 1.8ml 的病毒液(病毒力價 108.0 TCID50/ml)放
入試管中混合均勻，於 4 ℃放置 10 小時。之後利用蒸發將 Ether 移
除之後將病毒液接種至 TO2 細胞株中並培養於 28℃恆溫培養箱中放
置 7 天後進行病毒力價之測定。實驗組則將病毒液的部份以 MEM 代替，
其他部分均相同(Jung et al., 1995, Kobayashi et al., 1997)。
7. 歐洲鰻皰疹病毒在 TO2 細胞株複製生長情形
15
取 3 瓶已培養 2 天 TO2 細胞株之 25 cm2 培養瓶各加入 100ml 之皰
疹病毒液(病毒力價 10
8.0
TCID50/ml)，感作 30 分鐘，並於每 5 分鐘輕
輕搖晃數次以增加病毒與細胞接觸的機會。然後將接種之病毒液倒出
並用 PBS 沖洗 2 次後培養於 28℃恆溫培養箱中並分別於 16、 48、 和
72 小時各取出一瓶。取出的培養瓶先放置於-20℃冰箱中，經過 3 次
的冷凍-解凍步驟後並利用細胞刮刀將仍附著於培養瓶的細胞刮下，連
含有病毒的培養液一併收集起來。經 2000Xg 離心 10 分鐘之後進行病
毒力價之測定 (Davidse et al., 1999)。
6. 激 發 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 潛 伏 感 染 發 病 之 實 驗
1. 歐洲鰻(Anguilla anguilla)來源
由台灣南部的養鰻業者所提供，並挑選外觀正常、健康並具活力之實
驗鰻，鰻魚的長度約為 150-200 cm，重量介於 70-80 g 左右，共 30 隻。
2. 實驗設計
實驗由鰻魚到達實驗室後的第 3 天開始，其中 15 隻實驗組的鰻魚連續
施打 7 天的 dxamethasone，注射方式為腹腔注射，劑量為 400mg，而對照
組則是施打 1mL 的生理食鹽水。每隔 2、9、16、23 及 30 天從實驗組及對
16
照組各取 3 隻鰻魚進行解剖及病毒分離。水質維持於 pH 值 6.7(Van
Nieuwstadt et al., 2001)。
3. 病毒分離
將鰻魚的內臟包括腦、鰓、心、消化系統、肝臟、膽囊、腎臟及皮膚
分別取出，浸置於磷酸鹽緩衝液中(phosphate-buffered saline，PBS)均
質化配置成 10% (w/v)懸浮液後於溫度 4℃中離心 3000xg 10 分鐘。 之後
將懸浮液穿過 0.45µm-pore filters 過濾。將過濾後的懸浮液接種至已
培養 2 天的 TO2 細胞株 16 孔盤(16-well plates,Corning)上。連續 14 天
每天觀察，如果細胞產生細胞病變，則將其放置於-20℃冰箱中；另外取
其懸浮液進行 PCR 測定已作為佐證。如果經過 14 天後細胞沒有產生細胞
病變，則取其懸浮液放置於-20℃冰箱中，經過 1 天後取出；於室溫解凍並
將附著於盤底的細胞用細胞 刮刀刮下後連懸浮液一併收集，於 4℃離心
2000Xg 10 分鐘後將病毒液收集起來。再接種一次，經過 14 天後如果仍
無細胞病變則判定為無病毒存在（Van Nieuwstadt et al., 2001）。
17
第
三
章
結
果
18
1.歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性(Cell Line Specificity)
歐洲鰻皰疹病毒可以在 EO 細胞株、RTG 細胞株、TO2 細胞株、EE 細胞株
及 EP1 細胞株上繁殖生長，具感受性的上述細胞會產生融合細胞(syncytial
cell)及巨大細胞(giant cell)的現象；而這也是皰疹病毒產生細胞病變的
主要特徵(Fenner et al., 1999)。
2 歐洲鰻皰疹病毒物理、化學特性
1. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 最 適 生 長 溫 度 之 測 定 (Optimal temperature
determination)
由病毒力價結果中發現，當培養溫度為 28℃時病毒力價最高 108.4
TCID50/ml，而於 15℃時病毒力價最低 102.62 TCID50/ml。病毒力價於 18℃、
20℃、24℃、26℃和 30℃時分別為 103.53 、10
TCID50/ml (圖 1)。
4.85
、10
5.5
、10
6.5
和 10
6.5
2.歐洲鰻皰疹病毒對溫度的容忍性之測定（Tolerance of temperature）
病毒在溫度 56℃ ，30 分鐘後呈現不穩定的狀態而失去活性，病毒
力價為 100 TCID50/ml。另外病毒力價於 18℃和 37℃時為 103.25 和 105.54
TCID50/ml (圖 2)。
19
3. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 對 酸 鹼 的 穩 定 性 之 測 定 (pH stability
determination)
病毒在 MEM pH 3 時呈現不穩定的狀態，病毒力價為 10 TCID50/ml，
pH 7 時呈現病毒力價穩定的狀態為 10
及 11 時病毒力價分別為 10
3.53
6
8.2
1.3
TCID50/ml，另外在 pH 5、9
4.9
、10 及 10
TCID50/ml
(圖 3)。
4. 歐洲鰻皰疹病毒對氯仿(Chloroform)敏感性之測定
經過 chloroform 處理過的實驗組歐洲鰻皰疹病毒均失去活性，
病毒力價 100 TCID50/ml；而對照組病毒力價為 108.1 TCID50/ml (表 1 )。
5. 歐洲鰻皰疹病毒對 IUdR 敏感性之測定
病毒經過 IUdR 處理過後實驗組病毒力價為 101.3 TCID50/ml，對照
組病毒力價為 107.8 TCID50/ml(表 1)。
6. 歐洲鰻皰疹病毒對乙醚(Ether)敏感性之測定
由 Ether 處理過後的實驗組病毒力價為 101.3 TCID50/ml ，對照組
病毒力價為 107.8 TCID50/ml (表 1)。
7. 歐洲鰻皰疹病毒在 TO2 細胞株複製生長情形
20
經皰疹病毒接種的 TO2 細胞株(培養於 28℃）於第一天就可以
觀察到細胞病變 -融合細胞 (syncytial cell) 及巨大細胞 (giant
cell)的出現，而第 3 天細胞就失去黏著性而脫落至 MEM 中。病毒於
接種後的第 1、2 及 3 天其力價分別為 10 、 10
(圖 4 )。
3.5
6.5
及 10
8.4
TCID50/ml
3. 激發歐洲鰻皰疹病毒潛伏感染發病之實驗
1.實驗結果
由實驗組（注射 dxamethasone）鰻魚的各部分臟器中可以分離出
皰疹病毒，而對照組則無病毒被分離出來。直到第 30 天為止，實驗組
與對照組之鰻魚均無鰻魚死亡出現。外觀上除了有 4 隻（4/15）實驗
組鰻魚在頭部出現水泡病變之外，其餘均無明顯的病灶出現 (圖 5)。
2.組織病理學變化
從皮膚切片下發現病毒的代謝性包涵體沉積於增生的上皮細胞
中，有多發性的黑色素巨噬細胞聚集於後腎實質部和脾臟(圖 6、7 )。
3.各臟器病毒分離結果
21
將病毒由內臟獨立分離出來的結果中實驗組與對照組各分離 5
次，其中脾臟為分離出病毒最多次數的臟器，共 6 次，分別為感染後
的第 2 天對照組及實驗組鰻魚以及感染後第 9、16、23、及 30 天的實
驗組鰻魚；其次是消化系統、肝臟及腎臟，共 5 次；均為感染後第 2、
9、16、23、及 30 天實驗組鰻魚；接下來是鰓及皮膚，共 4 次為感染
後第 9、16、23、及 30 天實驗組鰻魚，最後是膽囊，共 1 次為感染後
第 16 天實驗組鰻魚；而腦及心臟並無病毒被分離出來(表 2)。
4. 各臟器分離病毒之平均力價結果
病毒之平均力價由高至低為腎臟、脾臟、肝臟、膽囊、鰓、消化
系統及皮膚，TCID50 分別是 102.55、102.23、102.0、101.86、101.76 、101.65 和
101.65 TCID50/ml(表 2)。
22
9
Temperature
圖 1 .歐洲鰻皰疹病毒接種在不同溫度之 TO2 細胞株後病毒
力價之變化情形。
23
•
Log
10
virus titer (TCID 50/ ml)
溫度
圖 2.歐洲鰻皰疹病毒經 18、 37 及 56℃處理後接種於 TO2
細胞株上病毒力價之變化情形。
24
•
Log 10 virus titer (TCID 50/ ml)
圖 3 .經過不同 pH 值處理過後之歐洲鰻皰疹病毒接種於 TO2 細
胞株上病毒力價變化情形。
25
•
Log 10 virus titer (TCID 50/ ml)
9
8.47
8
7
6.5
6
5
4
3.53
3
2
1
0
1
2
3
接種後之天數
圖 4 . 歐洲鰻皰疹病毒接種在 28℃之 TO2 細胞株後病毒力價之
變化情形。
26
圖.5 為其中一隻鰻魚在頭部及前鰭分別有水泡樣的病灶及點狀
出血產生（注射 Dxamethasone 後 23 天的實驗組鰻魚）。
27
圖.6
實驗組鰻魚之皮膚上皮細胞可以發現二次代謝性的
包涵體 (黑色箭頭指標) (H&E 100X)。
28
圖.7 大量多發點狀的黑色素巨噬細胞聚集於實驗組鰻魚之
後腎實質部(黑色箭頭指標) (H&E 100X)。
表一、 在 TO2 細胞株上由氯仿、5-iodo-2-deoxyuridine(IUdR)、及
乙醚處理過後歐洲鰻? 疹病毒病毒力價變化之結果。
29
病毒力價, TCID 50/ml
變數因子
氯仿
IUdR
乙醚
處理前
8.1
7.8
7.4
處理後
0
< 1.5
< 1.3
表二、由實驗組歐洲鰻中各臟器分離出? 疹病毒次數之總和及病毒力價之結果。
臟器
鰓
分離出病毒之次數
4
平均之病毒力價, log10 TCID 50/ml
1.76
30
消化系統
肝臟
膽囊
脾臟
腎臟
皮膚
5
5
1
6
5
4
1.65
2.0
1.86
2.23
2.55
1.65
31
第
四
章
討
論
在歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性方面，結果顯示歐洲鰻皰疹病
毒可以在 EO 細胞株、RTG 細胞株、TO2 細胞株、EE 細胞株及 EP1 細胞株上繁
殖生長，另外，EK1(eel kidney)(Chen et al., 1982, Davidse et al., 1999)
32
及 FHM (Davidse et al., 1999) 也有相關報告；但是在本次實驗當中並沒
有觀察到 EK1 及 FHM 有細胞病變產生。雖然各株的細胞外貌不相似，但是產
生細胞病變時；均會形成的融合細胞或巨大細胞，在倒立顯微鏡下呈圓形化，
比一般正常細胞更大。當細胞病變進入末期時，大量的細胞失去附著力而懸
浮於 MEM 當中，還附著於瓶底的細胞則失去原有細胞型態。
在病毒最適生長溫度方面，於 Frederick A. et al(1999) 指出造成
Channel catfish 100﹪死亡率的皰疹病毒其發病溫度為 30℃，而在美國年
幼的 Rainbow trout 感染皰疹病毒其發病溫度則為 6-9℃，由此可知由造成
皰疹病毒發病的溫度差異相當大；本實驗結果得知歐洲鰻皰疹病毒在 28℃時
病毒力價最高(108.4 TCID50/mL)，而隨著溫度下降，病毒力價也隨之下降。
Haenen O.L.M.et al.(2002)研究中提到荷蘭歐洲鰻皰疹病毒易爆發於水溫
25-26℃的夏季，當水溫下降時，死亡率也隨之減少。由於本實驗主要是在生
物體外的實驗(in vitro)，病毒在單層細胞上生長，缺少了自然寄主的其他
生化因子干擾；如免疫系統中的白血球、淋巴球或是干擾素等，所以我們只
能推論當病毒在自然界或是養殖環境中時，外在的溫度降低可以同樣減緩病
毒的複製能力及活力。配合 Haenen O.L.M. et al.(2002）所做的研究，我
們可以建議發病的鰻魚場盡量降低飼養溫度以減少死亡率。
在病毒對溫度的容忍性方面相較於 Parvovirus 在 60℃，60 分鐘仍穩定
的狀況(Frederick A. et al.,1999)之下，歐洲鰻皰疹病毒於 56℃，30 分鐘
33
時病毒會死亡而失去活性。在病毒對 pH 值方面，正常的養殖場的水質為微酸
性，就實驗結果得知 pH 值 3-5 間歐洲鰻皰疹病毒的病毒力價呈現不穩定的狀
態(TCID50 /ml< 10 )，而當 pH 由 5-7 之間提昇時病毒力價開始上升(10 TCID50
/ml)，至 pH 9-11 時又開始下降(10 TCID50 /ml)。水值的酸鹼度與病毒之間
的關係可以提供我們一個調控外在環境的因子之一(Frederick A. et al.,
1999)。
具有封套的病毒在複製過程中最後形成封套的過程，是將寄主細胞細胞
膜上酯質加上病毒本身的蛋白質合併所形成。Feldman (1961)中提到具封套
的病毒，如 Irdovirus、poxvirus 對酯溶性溶劑敏感，如 ether、chloroform；
而歐洲鰻皰疹病毒具有封套，故對酯溶性溶劑，敏感，實驗結果經過 ether、
chloroform 處理過的實驗組病毒力價均下降或消失(101.3 TCID50 /ml-100 TCID50
/ml)；封套的存在與否也是病毒在分類及鑑定上一個重要的依據。
利用 IUdR 主要在測定病毒為 DNA 或是 RNA 病毒。 IUdR 可以抑制 DNA 病
毒的複製是由於 DNA 核酸中之胸腺嘧啶（Thymidine）會被結構相似的鹵化
嘧啶，如 BudR 或 IUdR 取代而與病毒 DNA 結合並阻止 mRNA 的形成進而產生了
缺陷病毒或不完全蛋白衣蛋白。利用鹵化嘧啶製成的藥劑目前多應用於人皰
疹病毒造成的口腔和角膜潰瘍與狗胃腸道、乳腺、肝和肺臟的惡性上皮細胞
癌（carcinoma）（Ahrens F. A. 1996）。歐洲鰻皰疹病毒經由 IUdR 處理過的
實驗組病毒力價明顯下降，故為 DNA 病毒。同樣的，在分類上病毒的基因種
4.9
1.3
8.3
34
類為 DNA 或 RNA 也是分類及鑑定上的重要依據。
Davidse et al（1999）在歐洲鰻皰疹病毒於細胞株複製生長的研究當中提到，
荷蘭分離出的皰疹病毒在培養溫度 26℃的 EK-1 細胞株上繁殖 2 天就可造成
50-90﹪的細胞病變，病毒力價在 10
8.0
至 10 TCID50 /mL 之間。而在本實驗中，
7.2
在培養溫度 28℃的 TO2 細胞株感染病毒之後需 3-4 天才可達 90﹪的細胞病
變，病毒力價於第 3 天達到最高 10 TCID50 /ml。兩者之間可能因為細胞株的
選擇或是地區性的不同所以造成了差異。而 Frederick A. et al(1999）研
究中提到，接種 Ictalurid Herpesvirus 至 Channel catfish 上，所需的發
病期間只要 3 天就可以達到 100﹪的死亡率；但針對歐洲鰻皰疹病毒在實驗
室當中病毒力價高低與臨床上發病的時間是否成正相關則，必須再做進一步
的研究。
在激發歐洲鰻皰疹病毒潛伏感染發病之實驗當中，鰻魚在飼養的過程因
為環境的改變而使取食意願降低，另外因為實驗進行的時間為冬天，溫度的
調控不易，故沒有加入溫度這個調控因子而利用室溫來進行實驗。實驗開始
至結束均沒有鰻魚死亡。在皰疹病毒發病所產生的外部病徵方面；一些研究
已經證實皰疹病毒的感染會造成致癌因子的變化；在有些魚類會形成癌症樣
病灶(tumor-like lesion)(Kimura et al., 1981b, Sano et al., 1983)，
或是皮膚上皮細胞增生(Bekesi et al., 1986 )及致瘤的形成(Frederick A.
et al, 1999）；而在鰻魚皰疹病毒方面，病毒造成瀕死的鰻魚外部病徵差異
8.4
35
極大。在日本鰻方面，大部分呈現鰓蒼白、腫脹以及有黏液樣的分泌物出現
在身體的表面上。.僅有少數的病鰻呈現肛鰭有出血點、肛門及泌尿生殖器紅
腫及下腹部的表面有點狀出血 (Lee et al. 1999)。
在荷蘭則發現歐洲病鰻鰓呈蒼白樣及鰭有出血點，在皮膚及鰭也有出血
點出現；有些病鰻全身皮膚產生潰瘍並伴隨有點狀出血以及出現肛門及頭部
紅腫的現象；皮膚失去原有的光滑及有腹水的產生 (Haenen O.L.M. et al.,
2002)。然而在台灣發生的歐洲鰻皰疹病毒並無發現上述之病徵出現(Chang
et al., 2002)。
於 內 部 病 徵 方 面 ； 皰 疹 病 毒 最 著 名 的 為 Marek’s Disease(Gallid
Herpesvirus 2)中造成坐骨神經的結腫大，另外，在幼犬的皰疹病毒疾病
(Canine Herpesvirus 1)當中，腎臟、腎上腺及胃腸消化道會有大量的出血
瘀 斑 出 現 ； 在 魚 類 感 染 皰 疹 病 毒 方 面 ， Channel Catfish (Lctalurid
Herpesvirus 1)內臟器官，特別是在肝臟及消化道會有出血及壞死的出現。
在歐洲鰻方面，荷蘭的病鰻內部臟器的病徵為脾及肝蒼白以及肝臟出血及膽
囊鬱血並伴隨有腹水出現 (Haenen et al., 2002)。台灣的病鰻內部臟器並
無特異性的病徵出現(Chang.et al., 2002)。而在本實驗當中，因為事先已
知採樣的鰻魚場已有皰疹病毒感染，所以第一次於對照組中的脾臟中分離出
病毒來並不意外，推測是因為外在環境改變造成緊迫而造成發病，而之後於
對照組就無病毒再被分離出來。在施打 dxamethasone 的實驗組鰻魚除 4 隻
36
(4/15）鰻魚頭上有水泡樣病變之外，多數鰻魚腹鰭及下顎有點狀出血的發
生，但我們並不認為這是歐洲鰻皰疹病毒所造成的主要病徵。在內部病徵方
面，實驗組及對照組均無特異性病徵出現。
在各臟器分離病毒次數統計當中，脾臟及後腎為分離出病毒最多次數的
臟器，至目前為止並沒有相關的研究可以證明脾臟及後腎與病毒主要增值器
官是否有關聯；在組織病理切片下，可以見到有多發性的黑色素巨噬細胞聚
集於脾臟和後腎的實質部，Chang et al(2002)利用 ISH 證明黑色素巨噬細胞
內有強烈的皰疹病毒訊號；證明黑色素巨噬細胞與皰疹病毒的存在與否有密
切的關係。另外在實驗組中頭部產生水泡病變的鰻魚增生上皮細胞中，在組
織病理切片下可以發現病毒的代謝性包涵體沉積。
於實驗組鰻魚身上分離出的歐洲鰻皰疹病毒，病毒力價均很低，分離出
的病毒其中最高於腎臟，最低於皮膚，分別為 102.55 TCID50/ml 及 101.65
TCID50/ml；雖然沒有研究證明要多少病毒力價才可以造成明顯的病灶或臨床
症狀，但是從本次實驗所的結果得知如此的病毒力價並沒有造成任何潰瘍或
是明顯臨床症狀；是因為溫度不夠或是其他因子所造成的及在幼鰻或成鰻遭
受歐洲鰻皰疹病毒感染後的致病性方面是否有差異則均尚待進一步研究。
鰓也許為皰疹病毒侵入的主要途徑(Haenen O.L.M.et al.,2002），由帶
毒的鰻魚釋放至水中的病毒，經由鰓侵入新寄主而進行感染是目前認為可能
37
的主要的傳播方式之一，另外一種經母鰻傳至子代的垂直感染方式目前尚未
有報告被提出。由本實驗再次證實了台灣的歐洲鰻有皰疹病毒有潛伏感染，
究竟是由國外進口鰻苗帶入或是原本就已經存在於台灣的鰻魚養殖場中，需
做進一步的研究。
Haenen et al(2002)認為最初的歐洲鰻皰疹病毒為野生的鰻魚族群帶進
飼養池內而傳播的而造成其他正常鰻魚的潛伏感染。帶毒的鰻魚由於無臨床
症狀而不易察覺；病毒經由養鰻人員接觸於兩個鰻魚養殖場之間而傳播，或
活鰻經由飛機載運至世界各國販賣或是飼養時，再次感染其他的鰻魚，而使
得被病毒感染的鰻魚數量越來越多；並且因為在無緊迫的條件之下，病毒無
法被分離到，使得預防檢測上更加困難。
促 使 皰 疹 病 毒 再 次 的 由潛 伏 感 染 的寄 主 身 上發 病 主 要 因 子 為 緊 迫
(Van Nieuwstadt et al., 2001, Haenen O.L.M.et al.,2002)，包含外在
因子如，水溫、水的酸鹼度、水的品質及飼養密度等等；及內在因子包含魚
本身的健康狀態、細菌的複合感染、寄生蟲引發的疾病等等。如果可以排除
造成緊迫的因子，就可以減少發病的機會。
由於目前並無疫苗可以應用於臨床，在快速的偵測方式發明之前，本實
驗藉由了解病毒的特性，試著提供一個不適於病毒複製生長的外在調控方
式，來做為預防歐洲鰻皰疹病毒發病及發病後控制的參考。
38
39
第
五
章
參
考
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獻
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53
2. google快訊
3.許多的搜尋資料庫 ex:華藝
4.台灣博碩士論文系統
5.學習從模仿開始
前
言
歐洲鰻皰疹病毒 (European eel Herpesvirus, EEHV) 在台灣循環水養殖系
統中分離出來造成了本島鰻魚極高的死亡率(Chang et al., 2002)。 於荷蘭採
用相同飼養模式所採樣之病鰻也分離出歐洲鰻皰疹病毒 (Davidse et al.,
1999) 。由台灣歐洲鰻分離出來的皰疹病毒去氧核糖核酸聚合? 片段 (Pol) 與
歐洲鰻皰疹病毒相似度達 99% (298/300) (Chang et al., 2002)。病毒主要特
性為持續性無臨床症狀的潛伏感染，於當內(internal factor)、外(external
factor)在因子造免疫力下降時則發病 (Davidse et al., 1999)。電子顯微鏡下
病毒的核蛋白衣 (nucleocapsids) 直徑大小約 100nm。成熟的病毒顆粒直徑大
小約 235 nm，其內並含有一個外面包含粗糙外膜 (capsule) 的六角形核蛋白衣
(nucleocapsid) 之電子緻密核心。組織病理學檢查於皮膚的上皮細胞中發現代
謝性包含體 (metabolic inclusion bodies)及內臟器官中有黑色素巨噬細胞
(melanomacrophages)聚集 (Chang et al., 2002)。
在台灣，大部分的歐洲鰻以循環水養殖系統超集約飼養，主要是因為可以節
省大量的養殖用水以提高鰻魚的產值。然而，感染歐洲鰻? 疹病毒的鰻魚一旦發
病沒有有效的治療方式；目前也無疫苗可以應用於臨床控制。因此，針對病毒的
特性建立一個適當的環境控制是非常重要的。本實驗旨在了解歐洲鰻? 疹病毒的
物理、化學特性及在緊迫因子之下病毒潛伏感染發病的情形；希望可以對歐洲鰻
養殖業者有些助益。
1
第
一
章
文 獻 回 顧
2
1. 皰疹病毒簡介
皰疹病毒科病毒存在於生物界多種生物體中；包含昆蟲、爬蟲類、兩棲
類、哺乳類及魚類；為一具有雙股去氧核糖核酸 (DNA) 及封套(envelope)
之病毒。病毒顆粒大小約 120-200 nm ，呈圓球形， 其外殼 （capsid） 由
162 個次蛋白衣（capsomer）組成，呈 20 面體結構。 核蛋白衣直徑約
100-110nm ，次蛋白衣呈球中空的三角形或五角形的管子為此病毒特徵性之
構造 (Fenner et al., 1999)。
皰疹病毒在基因上有 3 種明顯的特色包含：G+C 的比率為 32-74﹪之間，
遠遠超過其他 DNA 的真核生物。基因變化大小主要在 125-235 kbp。病毒基
因組成複雜，如反覆的 DNA 片端出現在兩端。另外，皰疹病毒的非構造性蛋
白與病毒本身及寄主細胞間的生長及免疫調控有關，可以使病毒在細胞中繁
殖時不會立刻殺死細胞，而將複製時間延長。皰疹病毒的潛伏感染基因目前
是認為位於寄主細胞染色體外(extrachomosomal)的游離體基因(episome)中
(Frederick A. et al., 1999)。
Roizman et al.(1981)將皰疹病毒由生物的特性來分類， Alpfa-、
Beta-、Gamma-herpesvirinae 三個亞科(subfamily)，Honess(1984)更進一
步細分出這三種亞科的基因體大小、結構、(G+C)比率(Roizman et al.,
1981 ； Boblot et al., 1992) 。 而 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 屬 於 皰 疹 病 毒 科
3
(Herpesviridae)尚未分類之亞科(unclassified)。
2. 皰疹病毒複製方面
Beta-及 Gamma-皰疹病毒複製的機制大部分是相同的但複製的速度較
Alpfa-皰疹病毒慢。當病毒的醣蛋白膜粒（glycoprotein peplomers ）與寄
主細胞上的接受器（receptor）結合時，病毒的核蛋白衣藉著病毒的封套與
寄主細胞膜的融合（fusion）或是胞飲作用（ endocytosis）進入寄主細胞中。
之後病毒的 DNA 蛋白複合物由核蛋白衣釋放出來並進入寄主細胞的細胞核中
(Fenner et al., 1999) 。 病 毒 成 熟 的 過 程 包 含 病 毒 完 整 的 DNA 內 衣
（endocapsidation）進入核蛋白衣內，而後病毒顆粒聚集成空泡進入細胞質
內，釋放藉著胞吐作用（exocytosis） 或細胞溶解作用（cytolysis）釋出
寄主細胞。在寄主細胞膜上的病毒特異性蛋白在細胞融合中扮演著如 Fc
receptors 的角色，並且被認為是引起免疫細胞融合的主要標地 (Fenner et
al., 1999) 。 病 毒 造 成 寄 主 細 胞 內 產 生 的 核 內 包 涵 體 （ Intranuclear
inclusion bodies）為皰疹病毒的主要特色，通常可以在適當固定及染色的
組織中發現以及由被皰疹病毒感染的動物細胞培養中發現(Fenner et al.
1999)。
3. 皰疹病毒潛伏性感染
皰疹病毒是無法在寄主體外生存良好的強依賴性病毒，一般主要由發病
4
動物的黏液傳播，如交配、互舔的動作、打噴嚏的飛沫、經母體傳至子代的
垂直傳染和幼畜之間互相的水平感染等，在大型密集飼養的族群中如牛場、
豬場及煮肉的工廠，打噴嚏及短距離的飛沫為主要的傳然途徑。而其主要藉
由持續性的潛伏感染及週期性的再發生和散發存在於族群的世代之間；皰疹
病毒是非常專一性的病毒，主要是因為在寄主身上的潛伏性感染造成與寄主
同時演化的結果，病毒只能在專一寄主上生存。潛伏性感染的特色使得皰疹
病毒可以永存在生物體上，即使是很小的孤立組群(Frederick A. et al.,
1999)。
週期性復發或是持續性的潛伏感染(Persistent infection)是皰疹病毒
的特性之一，從分類的角度上來看潛伏感染；Alfa-皰疹病毒感染生物體後為
了躲避寄主細胞的免疫系統攻擊會躲藏在寄主神經系統掌控感覺的神經節當
中，Beta-皰疹病毒則是躲藏在寄主的分泌腺、淋巴網狀內皮細胞的組織以及
腎臟當中；Gama-皰疹病毒則是主要躲藏於淋巴組織當中。少部分的 Beta 及
Gama-皰疹病毒潛伏於皮膚表面的上皮細胞中。在潛伏感染狀態下 (Latent
infection)，此時感染動物沒有任何臨床症狀，也分離不到具感染能力的病
毒(Rziha et al., 1986)。
經過多次複製的病毒 DNA 或形成游離基因或少部分與寄主之神經元細胞
染色體 DNA 合併造成潛伏感染。潛伏感染的皰疹病毒基因是不被轉錄的除非
外來因子激起了潛伏感染有關之轉錄體(Latently-associated transcript,
5
LATs)(Fenner et al., 1999)。病毒的轉錄 RNA 在複製的過程中並不會形成
蛋白質；其只要的功能在於建立、維持以及再活化潛伏感染之病毒，主要促
使再活化機制的因子至今尚未完全了解。激起潛伏感染再活化的因子主要是
緊迫，包含了合併感染、運輸以及擁擠或是高密度的飼養環境(Fenner et al.,
1999, Frederick A. et al., 1999)。
4. 在歐洲鰻皰疹病毒方面
而在歐洲鰻皰疹病毒方面 Van Nieuwstadt et al.(2001)則證實了在臨
床上是健康或是發病的歐洲鰻即使身上有特異性抗體的存在，潛伏感染的情
形也同樣存在。歐洲鰻皰疹病毒潛伏性感染的位置，Chang et al. (2002)
以原位雜交法(In situ hybridization, ISH) 在外觀無病灶的歐洲鰻的皮
膚、肝、脾和腎檢測出黑色素巨噬細胞內含有歐洲鰻皰疹病毒之核酸，證明
了被活化的皰疹病毒會出現於組織器官中中，但是原本病毒躲藏的位置目前
尚不清楚。而歐洲鰻感染皰疹病毒的方式可能是病魚排毒至水中時，健康鰻
經由鰓接觸病毒而感染，或由母鰻經排卵或排卵過程污染而傳至子代。具有
潛伏感染的歐洲鰻受到緊迫時排毒的路徑目前為止仍然不清楚
(Haenen,O.L.M. et al., 2002）。
6
5. 皰疹病毒魚類宿主範圍
最 早 的 文 獻 記 載 為 Perciformes 目 Percidae 科 之 大 眼 魚
(Walleye)(Kelly et al., 1931)之後，斑點叉鯰魚(Channel catfish)(Wolf
and Heman , 1971)、紅鮭魚(Sockeye salmon)(Sano et al., 1976)、紅鱒
魚(Rainbow trout) (Wolf et al., 1978)、刺鯧(Psetta maximal)(Buchanan
et al., 1978)、白斑狗魚(Northern pike) (Yamamoto. 1984)、鯉魚(Common
carp)(Sano et al. ,1985)、大星鯊(Smooth dogfish)(Leibovitz et al.,
1985)、銀大麻哈鮭魚(Coho salmon)(Horiuchi et al., 1989)、湖鱒(Lake
trout)(Bradley et al., 1989)、白鱘(White sturgeon)(Hedrick et al.,
1991)、日本鰻魚(Japanese eel)(Ueno et al., 1992)及歐洲鰻魚(European
eel)(Davidse et al., 1999)均有相關報告。
6. 歐洲鰻之簡介
歐洲鰻，英文名為 European eel 屬於硬骨魚類，學名為 Anguilla
anguilla ， 在 分 類 上 屬 於 Actinopterygii 綱 ， Anguilliformes 目 及
Anguillidae 科 (Stoskopf. 1993)。他們是闊頭及海移棲淡水河產卵的物種
(euryhaline and anadromous species)。年輕的鰻魚於淡水中成長，雄性的
鰻魚在於淡水生活 6 至 12 年，雌性的鰻魚則是 9 至 20 年；當生長期結束鰻
7
魚達性成熟之後他們就遷移至海洋中，居住於深海底部。成鰻在遷移時不進
食，配子形成(Gametogenesis)主要發生於接近馬尾藻海洋(Sargasso Sea)
其為北大西洋一海域，在西印度群島與亞速群島之間，有大量海藻漂浮其平
靜海面。產卵時間於晚東及春天時。經卵孵化後之狹首型幼鰻(Leptocephali)
隨著墨西哥灣流到達歐洲沿海，由卵的孵化地至歐洲沿海最長可達 3 年的時
間；在到達沿海的入河口時，狹首型幼鰻會轉變成幼鰻(Elver)。在進入淡水
河流域時幼鰻會加速成熟以適應河水中的溫度。(Stoskopf,1993)。成鰻主要
分部於北大西洋、波羅海、地中海、亞洲南部及美國中部的海域；在歐洲沿
海的黑海(Black sea)至白海(White sea)之間也是他們生長的地區(Stoskopf.
1993)。
7. 鰻魚皰疹病毒之回顧
1985 年 ， 鰻 魚 皰 疹 病 毒 (Herpesvirus anguillae)在 亞 洲 由 日 本 鰻
(Anguilla japonica)及歐洲鰻(Anguilla
anguilla)首次分離出來 (Sano
et al., 1990)，發病的鰻魚在皮膚及肝臟上分別出現紅斑及壞死等病灶，死
亡率約為 1%至 6.8%。Kobayashi et al. (1997) 首次的描述皰疹病毒在日本
鰻的皮膚上形成嚴重的病灶。Ueno et al. (1996) 藉著細胞融合的發生，交
叉反應中和抗體力價實驗 (cross reactivity in neutralization tests)
及 構 造 性 蛋 白 的 電 泳 結 果 (electrophoretic patterns of structural
8
proteins)證明了日本鰻感染了皰疹病毒。 Lee et al. (1999) 描述了被皰
疹病毒感染的日本鰻鰓絲壞死之情形。Bekesi et al. (1986) 證明發生在匈
牙利歐洲鰻皮膚病灶上的病毒是皰疹病毒，但尚無法被分離出來。Jorgensen
et al. （1994）在法國由無發病的歐洲鰻上分離出皰疹病毒。 Davidse et al.
(1999) 首次在荷蘭飼養於循環水養殖系統中的歐洲病鰻分離出皰疹病毒；自
1996 年起，由爆發疾病的歐洲病鰻分離出來的各臟器中經由電子顯微鏡檢查
的結果均可發現皰疹病毒的存在。 Van Nieuwstadt et al. (2001) 證實了
歐洲鰻皰疹病毒具有潛伏性的感染，並且可以因為外在因子如溫度、飼養密
度、水質等改變造成的緊迫而導致發病。
8. 台灣鰻魚飼養之近況
鰻魚主要養殖在嘉義縣、彰化縣、雲林縣、台南縣、屏東縣及高雄縣，
以集約飼養為主(Chen. 1998)；台灣鰻魚養殖可以分成四個階段 由 1923∼
57 的發展期，1958∼69 萌芽期，1970∼78 成長期，及 1979∼90 繁榮與調整
期至今的衰退期；1991 年起，鰻魚養殖產業進入不景氣階段，產量從 1991
年約 5 萬 6 千噸衰退至 1996 年不到一半的 2 萬 5 千噸，平均生產力從 1991
年的每公頃 14.8 噸降至 1996 年的 6.8 噸 (Chen. 1998)。主要的原因是因為
中國的鰻魚養殖產業有較多的優勢，像日本鰻苗來源充足、優質水源豐沛、
人工成本低以及從台灣及日本轉移過去的現代科技等使得台灣的鰻魚養殖一
9
厥不振 (Chen. 1998)。
1990 至 1992 之間，日本超過 50%的鰻魚是由台灣出口，為解決鰻苗短
缺以及增加鰻魚產值，台灣省水產試驗所在 1991 年引進丹麥的超集約循環水
養鰻系統，並應用於歐洲鰻之飼養中。這種系統的優點主要可以節省大量的
用水以避免過度抽取地下水造成的地層下陷的問題及增加鰻魚的產值 (Chen.
1998, Shi. 1999)。
台灣的歐洲鰻苗主要經由法國及英國進口而來，平均一年 1 至 2 次。台
灣的歐洲鰻大都飼養於循環水系統中，經過 1 至 2 年的飼養後移至室外池繼
續飼養半年；而後大部分的鰻魚均輸出海外，70%.輸出至日本，20%輸出至韓
國剩下的 10%則內銷(Chen. 1998, Shi. 1999)。
9. 實驗目的
近年來無論是台灣或者是歐洲的歐洲鰻養殖業者均致力尋找一個有效的
方式來預防或是治療皰疹病毒，但是由於病毒潛伏感染的特性使得帶毒鰻魚
外觀並無異樣，使得預防非常困難；而當發病時則難以控制；目前並無疫苗
可以應用於臨床，所以本實驗之目的希望進一步了解歐洲鰻皰疹病毒物理化
學之基本特性，希望可以應用外在因子的控制方式，來降低病毒的發生率已
達到減少發病時漁民的損失。
10
第
二
章
材 料 與 方 法
11
1.
歐洲鰻皰疹病毒之分離
歐洲鰻皰疹病毒之分離方式參照 潘毅豪,(2001)之方法進行。
2.
細胞
吳郭魚的卵巢細胞(TO2)為本實驗主要應用之細胞株，以細胞培養液
(Eagle’s minimum essential medium, MEM, HyClone, Denmark)加 10
﹪胎牛血清(Fetal Bovine serum, FBS, HyClone, Denmark)培養成單層
細胞後備用(潘, 2001)。
3.
歐洲鰻皰疹病毒之準備
皰疹病毒之來源為由 2001 年在台灣北部發病之歐洲鰻分離而來(Pan,
2001) 首先，將病毒以 0.1 至 0.01 感染複數(Multiplicity of infection,。
MOI)接種至 TO2 細胞株上，待其細胞病變(CPE)完全後，將病毒及血清培
養液收集起來並儲存至-60℃中備用(潘, 2001)。病毒力價 TCID50/ml(The
50﹪tissue culture infectious dose)之計算方法參考 Reed and Muench
(1938)發表的算法。
4.
歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性(Cell Line Specificity)
利用 9 株細胞來測定歐洲鰻皰疹病毒是否會對不同細胞造成細胞病
變。實驗之細胞株包含：鰻魚的表皮細胞(EE)、鰻魚的卵巢細胞(EO)、鯉
魚的乳頭上皮細胞(EPC)、鰻魚的上皮細胞(EP1)、大翻車魚細胞(BF2)、
12
虹鱒魚細胞(RTG)、大臉? 魚細胞(FHM)、吳郭魚的卵巢細胞(TO2)及契奴
克魚胚胎細胞(CHSE)。
將各細胞株培養於含有 10﹪胎牛血清的細胞培養液中，並事先於培
養 液 中 加 入 50IU/mL 的 青 黴 素 (penicillin) 及 50mg/ml 的 鏈 黴 素
(streptomycin)；除了 CHSE 及 RTG 放置於 20℃恆溫培養箱外，其餘細胞
均放置於 28℃恆溫培養箱中培養三天。待細胞長滿於 25 cm 的培養瓶
(Flask, NUNC, Denmark)後將 100 ml，病毒力價 10
8.0
2
TCID50/ml 之皰疹病
毒接種(Inoculated)於各細胞株上；感染 30 分鐘，並於每 5 分鐘輕輕搖
晃數次以增加病毒與細胞接觸的機會。然後將接種之病毒液倒出並用 PBS
沖洗 2 次後，加入含有 2﹪胎牛血清的細胞培養液後進行觀察是否有細胞
病變發生 (Davides et al., 1999). 。
5.
歐洲鰻皰疹病毒物理、化學特性
1. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 最 適 生 長 溫 度 之 測 定 (Optimal temperature
determination)
將病毒如前述接種入培養於於 25cm2 培養瓶的 TO2 細胞株上後分
別放入 18、20、24、26、28 和 30℃恆溫培養箱中進行培養。四天後
將病毒及血清培養液收集起來並進行病毒力價之測定 (Eaton et al.,
13
1992, Winton et al., 1985)。
2. 歐洲鰻皰疹病毒對溫度的容忍性之測定(Tolerance of temperature)
將含 1ml 的病毒液(病毒力價 10
8.0
TCID50/ml)之試管分別放置於
18、37 和 56℃恆溫培養箱中，待 30 分鐘後接種於已培養 3 天 TO2
細胞之 96 孔盤上(96-wells plate, Corning, Austria)進行病毒力
價之測定 (Winton et al., 1985)。
3. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 對 酸 鹼 的 穩 定 性 之 測 定 (pH stability
determination)
將 EMEM 分別調成 pH 3、5、7、9 和 11 再分別取 4ml 放入試管中；
之後個別加入 1ml 的病毒液（病毒力價 108.0 TCID50/ml）並放置於 28℃
恆溫培養箱中，30 分鐘後接種 96 孔盤上進行病毒力價之測定 (Winton
et al., 1985, Eaton et al., 1992)。
4. 歐洲鰻皰疹病毒對氯仿(Chloroform)敏感性之測定
根據 Feldman and Wang (1961)，首先將 1mL Chloroform 加入 2ml
的病毒液(病毒力價 108.0 TCID50/ml)試管中，震動 15 分鐘後於 4℃以
2000xg 離心 10 分鐘後將病毒接種於 25 cm2 培養瓶的 TO2 細胞株上；
14
放置於 28℃恆溫培養箱中；7 天之後進行病毒力價之測定。另設一實
驗組，將病毒液的部份以 MEM 代替，其他部分均相同。(Eaton et al.,
1992, Winton et al., 1985, Kasornchandra et al., 1997)。
5. 歐洲鰻皰疹病毒對 IUdR 敏感性之測定
把 50mg 的 IudR(5-iodo-2'-deoxyuridine)及 2ml 的病毒液(病
毒力價 10
8.0
TCID50/mL)放入試管中混合均勻，再接種至 TO2 細胞株中
放置於 28℃恆溫培養箱中，7 天後測定病毒力價之改變。實驗組則將
病毒液的部份以 MEM 代替，其他部分均相同。 (Kuchler et al.,1977,
Winton et al., 1985, Kasornchandra et al., 1997)。
6. 歐洲鰻皰疹病毒對乙醚(Ether)敏感性之測定
將 0.2ml Ether 及 1.8ml 的病毒液(病毒力價 108.0 TCID50/ml)放
入試管中混合均勻，於 4 ℃放置 10 小時。之後利用蒸發將 Ether 移
除之後將病毒液接種至 TO2 細胞株中並培養於 28℃恆溫培養箱中放
置 7 天後進行病毒力價之測定。實驗組則將病毒液的部份以 MEM 代替，
其他部分均相同(Jung et al., 1995, Kobayashi et al., 1997)。
7. 歐洲鰻皰疹病毒在 TO2 細胞株複製生長情形
15
取 3 瓶已培養 2 天 TO2 細胞株之 25 cm2 培養瓶各加入 100ml 之皰
疹病毒液(病毒力價 10
8.0
TCID50/ml)，感作 30 分鐘，並於每 5 分鐘輕
輕搖晃數次以增加病毒與細胞接觸的機會。然後將接種之病毒液倒出
並用 PBS 沖洗 2 次後培養於 28℃恆溫培養箱中並分別於 16、 48、 和
72 小時各取出一瓶。取出的培養瓶先放置於-20℃冰箱中，經過 3 次
的冷凍-解凍步驟後並利用細胞刮刀將仍附著於培養瓶的細胞刮下，連
含有病毒的培養液一併收集起來。經 2000Xg 離心 10 分鐘之後進行病
毒力價之測定 (Davidse et al., 1999)。
6. 激 發 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 潛 伏 感 染 發 病 之 實 驗
1. 歐洲鰻(Anguilla anguilla)來源
由台灣南部的養鰻業者所提供，並挑選外觀正常、健康並具活力之實
驗鰻，鰻魚的長度約為 150-200 cm，重量介於 70-80 g 左右，共 30 隻。
2. 實驗設計
實驗由鰻魚到達實驗室後的第 3 天開始，其中 15 隻實驗組的鰻魚連續
施打 7 天的 dxamethasone，注射方式為腹腔注射，劑量為 400mg，而對照
組則是施打 1mL 的生理食鹽水。每隔 2、9、16、23 及 30 天從實驗組及對
16
照組各取 3 隻鰻魚進行解剖及病毒分離。水質維持於 pH 值 6.7(Van
Nieuwstadt et al., 2001)。
3. 病毒分離
將鰻魚的內臟包括腦、鰓、心、消化系統、肝臟、膽囊、腎臟及皮膚
分別取出，浸置於磷酸鹽緩衝液中(phosphate-buffered saline，PBS)均
質化配置成 10% (w/v)懸浮液後於溫度 4℃中離心 3000xg 10 分鐘。 之後
將懸浮液穿過 0.45µm-pore filters 過濾。將過濾後的懸浮液接種至已
培養 2 天的 TO2 細胞株 16 孔盤(16-well plates,Corning)上。連續 14 天
每天觀察，如果細胞產生細胞病變，則將其放置於-20℃冰箱中；另外取
其懸浮液進行 PCR 測定已作為佐證。如果經過 14 天後細胞沒有產生細胞
病變，則取其懸浮液放置於-20℃冰箱中，經過 1 天後取出；於室溫解凍並
將附著於盤底的細胞用細胞 刮刀刮下後連懸浮液一併收集，於 4℃離心
2000Xg 10 分鐘後將病毒液收集起來。再接種一次，經過 14 天後如果仍
無細胞病變則判定為無病毒存在（Van Nieuwstadt et al., 2001）。
17
第
三
章
結
果
18
1.歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性(Cell Line Specificity)
歐洲鰻皰疹病毒可以在 EO 細胞株、RTG 細胞株、TO2 細胞株、EE 細胞株
及 EP1 細胞株上繁殖生長，具感受性的上述細胞會產生融合細胞(syncytial
cell)及巨大細胞(giant cell)的現象；而這也是皰疹病毒產生細胞病變的
主要特徵(Fenner et al., 1999)。
2 歐洲鰻皰疹病毒物理、化學特性
1. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 最 適 生 長 溫 度 之 測 定 (Optimal temperature
determination)
由病毒力價結果中發現，當培養溫度為 28℃時病毒力價最高 108.4
TCID50/ml，而於 15℃時病毒力價最低 102.62 TCID50/ml。病毒力價於 18℃、
20℃、24℃、26℃和 30℃時分別為 103.53 、10
TCID50/ml (圖 1)。
4.85
、10
5.5
、10
6.5
和 10
6.5
2.歐洲鰻皰疹病毒對溫度的容忍性之測定（Tolerance of temperature）
病毒在溫度 56℃ ，30 分鐘後呈現不穩定的狀態而失去活性，病毒
力價為 100 TCID50/ml。另外病毒力價於 18℃和 37℃時為 103.25 和 105.54
TCID50/ml (圖 2)。
19
3. 歐 洲 鰻 皰 疹 病 毒 對 酸 鹼 的 穩 定 性 之 測 定 (pH stability
determination)
病毒在 MEM pH 3 時呈現不穩定的狀態，病毒力價為 10 TCID50/ml，
pH 7 時呈現病毒力價穩定的狀態為 10
及 11 時病毒力價分別為 10
3.53
6
8.2
1.3
TCID50/ml，另外在 pH 5、9
4.9
、10 及 10
TCID50/ml
(圖 3)。
4. 歐洲鰻皰疹病毒對氯仿(Chloroform)敏感性之測定
經過 chloroform 處理過的實驗組歐洲鰻皰疹病毒均失去活性，
病毒力價 100 TCID50/ml；而對照組病毒力價為 108.1 TCID50/ml (表 1 )。
5. 歐洲鰻皰疹病毒對 IUdR 敏感性之測定
病毒經過 IUdR 處理過後實驗組病毒力價為 101.3 TCID50/ml，對照
組病毒力價為 107.8 TCID50/ml(表 1)。
6. 歐洲鰻皰疹病毒對乙醚(Ether)敏感性之測定
由 Ether 處理過後的實驗組病毒力價為 101.3 TCID50/ml ，對照組
病毒力價為 107.8 TCID50/ml (表 1)。
7. 歐洲鰻皰疹病毒在 TO2 細胞株複製生長情形
20
經皰疹病毒接種的 TO2 細胞株(培養於 28℃）於第一天就可以
觀察到細胞病變 -融合細胞 (syncytial cell) 及巨大細胞 (giant
cell)的出現，而第 3 天細胞就失去黏著性而脫落至 MEM 中。病毒於
接種後的第 1、2 及 3 天其力價分別為 10 、 10
(圖 4 )。
3.5
6.5
及 10
8.4
TCID50/ml
3. 激發歐洲鰻皰疹病毒潛伏感染發病之實驗
1.實驗結果
由實驗組（注射 dxamethasone）鰻魚的各部分臟器中可以分離出
皰疹病毒，而對照組則無病毒被分離出來。直到第 30 天為止，實驗組
與對照組之鰻魚均無鰻魚死亡出現。外觀上除了有 4 隻（4/15）實驗
組鰻魚在頭部出現水泡病變之外，其餘均無明顯的病灶出現 (圖 5)。
2.組織病理學變化
從皮膚切片下發現病毒的代謝性包涵體沉積於增生的上皮細胞
中，有多發性的黑色素巨噬細胞聚集於後腎實質部和脾臟(圖 6、7 )。
3.各臟器病毒分離結果
21
將病毒由內臟獨立分離出來的結果中實驗組與對照組各分離 5
次，其中脾臟為分離出病毒最多次數的臟器，共 6 次，分別為感染後
的第 2 天對照組及實驗組鰻魚以及感染後第 9、16、23、及 30 天的實
驗組鰻魚；其次是消化系統、肝臟及腎臟，共 5 次；均為感染後第 2、
9、16、23、及 30 天實驗組鰻魚；接下來是鰓及皮膚，共 4 次為感染
後第 9、16、23、及 30 天實驗組鰻魚，最後是膽囊，共 1 次為感染後
第 16 天實驗組鰻魚；而腦及心臟並無病毒被分離出來(表 2)。
4. 各臟器分離病毒之平均力價結果
病毒之平均力價由高至低為腎臟、脾臟、肝臟、膽囊、鰓、消化
系統及皮膚，TCID50 分別是 102.55、102.23、102.0、101.86、101.76 、101.65 和
101.65 TCID50/ml(表 2)。
22
9
Temperature
圖 1 .歐洲鰻皰疹病毒接種在不同溫度之 TO2 細胞株後病毒
力價之變化情形。
23
•
Log
10
virus titer (TCID 50/ ml)
溫度
圖 2.歐洲鰻皰疹病毒經 18、 37 及 56℃處理後接種於 TO2
細胞株上病毒力價之變化情形。
24
•
Log 10 virus titer (TCID 50/ ml)
圖 3 .經過不同 pH 值處理過後之歐洲鰻皰疹病毒接種於 TO2 細
胞株上病毒力價變化情形。
25
•
Log 10 virus titer (TCID 50/ ml)
9
8.47
8
7
6.5
6
5
4
3.53
3
2
1
0
1
2
3
接種後之天數
圖 4 . 歐洲鰻皰疹病毒接種在 28℃之 TO2 細胞株後病毒力價之
變化情形。
26
圖.5 為其中一隻鰻魚在頭部及前鰭分別有水泡樣的病灶及點狀
出血產生（注射 Dxamethasone 後 23 天的實驗組鰻魚）。
27
圖.6
實驗組鰻魚之皮膚上皮細胞可以發現二次代謝性的
包涵體 (黑色箭頭指標) (H&E 100X)。
28
圖.7 大量多發點狀的黑色素巨噬細胞聚集於實驗組鰻魚之
後腎實質部(黑色箭頭指標) (H&E 100X)。
表一、 在 TO2 細胞株上由氯仿、5-iodo-2-deoxyuridine(IUdR)、及
乙醚處理過後歐洲鰻? 疹病毒病毒力價變化之結果。
29
病毒力價, TCID 50/ml
變數因子
氯仿
IUdR
乙醚
處理前
8.1
7.8
7.4
處理後
0
< 1.5
< 1.3
表二、由實驗組歐洲鰻中各臟器分離出? 疹病毒次數之總和及病毒力價之結果。
臟器
鰓
分離出病毒之次數
4
平均之病毒力價, log10 TCID 50/ml
1.76
30
消化系統
肝臟
膽囊
脾臟
腎臟
皮膚
5
5
1
6
5
4
1.65
2.0
1.86
2.23
2.55
1.65
31
第
四
章
討
論
在歐洲鰻皰疹病毒對不同細胞株之特異性方面，結果顯示歐洲鰻皰疹病
毒可以在 EO 細胞株、RTG 細胞株、TO2 細胞株、EE 細胞株及 EP1 細胞株上繁
殖生長，另外，EK1(eel kidney)(Chen et al., 1982, Davidse et al., 1999)
32
及 FHM (Davidse et al., 1999) 也有相關報告；但是在本次實驗當中並沒
有觀察到 EK1 及 FHM 有細胞病變產生。雖然各株的細胞外貌不相似，但是產
生細胞病變時；均會形成的融合細胞或巨大細胞，在倒立顯微鏡下呈圓形化，
比一般正常細胞更大。當細胞病變進入末期時，大量的細胞失去附著力而懸
浮於 MEM 當中，還附著於瓶底的細胞則失去原有細胞型態。
在病毒最適生長溫度方面，於 Frederick A. et al(1999) 指出造成
Channel catfish 100﹪死亡率的皰疹病毒其發病溫度為 30℃，而在美國年
幼的 Rainbow trout 感染皰疹病毒其發病溫度則為 6-9℃，由此可知由造成
皰疹病毒發病的溫度差異相當大；本實驗結果得知歐洲鰻皰疹病毒在 28℃時
病毒力價最高(108.4 TCID50/mL)，而隨著溫度下降，病毒力價也隨之下降。
Haenen O.L.M.et al.(2002)研究中提到荷蘭歐洲鰻皰疹病毒易爆發於水溫
25-26℃的夏季，當水溫下降時，死亡率也隨之減少。由於本實驗主要是在生
物體外的實驗(in vitro)，病毒在單層細胞上生長，缺少了自然寄主的其他
生化因子干擾；如免疫系統中的白血球、淋巴球或是干擾素等，所以我們只
能推論當病毒在自然界或是養殖環境中時，外在的溫度降低可以同樣減緩病
毒的複製能力及活力。配合 Haenen O.L.M. et al.(2002）所做的研究，我
們可以建議發病的鰻魚場盡量降低飼養溫度以減少死亡率。
在病毒對溫度的容忍性方面相較於 Parvovirus 在 60℃，60 分鐘仍穩定
的狀況(Frederick A. et al.,1999)之下，歐洲鰻皰疹病毒於 56℃，30 分鐘
33
時病毒會死亡而失去活性。在病毒對 pH 值方面，正常的養殖場的水質為微酸
性，就實驗結果得知 pH 值 3-5 間歐洲鰻皰疹病毒的病毒力價呈現不穩定的狀
態(TCID50 /ml< 10 )，而當 pH 由 5-7 之間提昇時病毒力價開始上升(10 TCID50
/ml)，至 pH 9-11 時又開始下降(10 TCID50 /ml)。水值的酸鹼度與病毒之間
的關係可以提供我們一個調控外在環境的因子之一(Frederick A. et al.,
1999)。
具有封套的病毒在複製過程中最後形成封套的過程，是將寄主細胞細胞
膜上酯質加上病毒本身的蛋白質合併所形成。Feldman (1961)中提到具封套
的病毒，如 Irdovirus、poxvirus 對酯溶性溶劑敏感，如 ether、chloroform；
而歐洲鰻皰疹病毒具有封套，故對酯溶性溶劑，敏感，實驗結果經過 ether、
chloroform 處理過的實驗組病毒力價均下降或消失(101.3 TCID50 /ml-100 TCID50
/ml)；封套的存在與否也是病毒在分類及鑑定上一個重要的依據。
利用 IUdR 主要在測定病毒為 DNA 或是 RNA 病毒。 IUdR 可以抑制 DNA 病
毒的複製是由於 DNA 核酸中之胸腺嘧啶（Thymidine）會被結構相似的鹵化
嘧啶，如 BudR 或 IUdR 取代而與病毒 DNA 結合並阻止 mRNA 的形成進而產生了
缺陷病毒或不完全蛋白衣蛋白。利用鹵化嘧啶製成的藥劑目前多應用於人皰
疹病毒造成的口腔和角膜潰瘍與狗胃腸道、乳腺、肝和肺臟的惡性上皮細胞
癌（carcinoma）（Ahrens F. A. 1996）。歐洲鰻皰疹病毒經由 IUdR 處理過的
實驗組病毒力價明顯下降，故為 DNA 病毒。同樣的，在分類上病毒的基因種
4.9
1.3
8.3
34
類為 DNA 或 RNA 也是分類及鑑定上的重要依據。
Davidse et al（1999）在歐洲鰻皰疹病毒於細胞株複製生長的研究當中提到，
荷蘭分離出的皰疹病毒在培養溫度 26℃的 EK-1 細胞株上繁殖 2 天就可造成
50-90﹪的細胞病變，病毒力價在 10
8.0
至 10 TCID50 /mL 之間。而在本實驗中，
7.2
在培養溫度 28℃的 TO2 細胞株感染病毒之後需 3-4 天才可達 90﹪的細胞病
變，病毒力價於第 3 天達到最高 10 TCID50 /ml。兩者之間可能因為細胞株的
選擇或是地區性的不同所以造成了差異。而 Frederick A. et al(1999）研
究中提到，接種 Ictalurid Herpesvirus 至 Channel catfish 上，所需的發
病期間只要 3 天就可以達到 100﹪的死亡率；但針對歐洲鰻皰疹病毒在實驗
室當中病毒力價高低與臨床上發病的時間是否成正相關則，必須再做進一步
的研究。
在激發歐洲鰻皰疹病毒潛伏感染發病之實驗當中，鰻魚在飼養的過程因
為環境的改變而使取食意願降低，另外因為實驗進行的時間為冬天，溫度的
調控不易，故沒有加入溫度這個調控因子而利用室溫來進行實驗。實驗開始
至結束均沒有鰻魚死亡。在皰疹病毒發病所產生的外部病徵方面；一些研究
已經證實皰疹病毒的感染會造成致癌因子的變化；在有些魚類會形成癌症樣
病灶(tumor-like lesion)(Kimura et al., 1981b, Sano et al., 1983)，
或是皮膚上皮細胞增生(Bekesi et al., 1986 )及致瘤的形成(Frederick A.
et al, 1999）；而在鰻魚皰疹病毒方面，病毒造成瀕死的鰻魚外部病徵差異
8.4
35
極大。在日本鰻方面，大部分呈現鰓蒼白、腫脹以及有黏液樣的分泌物出現
在身體的表面上。.僅有少數的病鰻呈現肛鰭有出血點、肛門及泌尿生殖器紅
腫及下腹部的表面有點狀出血 (Lee et al. 1999)。
在荷蘭則發現歐洲病鰻鰓呈蒼白樣及鰭有出血點，在皮膚及鰭也有出血
點出現；有些病鰻全身皮膚產生潰瘍並伴隨有點狀出血以及出現肛門及頭部
紅腫的現象；皮膚失去原有的光滑及有腹水的產生 (Haenen O.L.M. et al.,
2002)。然而在台灣發生的歐洲鰻皰疹病毒並無發現上述之病徵出現(Chang
et al., 2002)。
於 內 部 病 徵 方 面 ； 皰 疹 病 毒 最 著 名 的 為 Marek’s Disease(Gallid
Herpesvirus 2)中造成坐骨神經的結腫大，另外，在幼犬的皰疹病毒疾病
(Canine Herpesvirus 1)當中，腎臟、腎上腺及胃腸消化道會有大量的出血
瘀 斑 出 現 ； 在 魚 類 感 染 皰 疹 病 毒 方 面 ， Channel Catfish (Lctalurid
Herpesvirus 1)內臟器官，特別是在肝臟及消化道會有出血及壞死的出現。
在歐洲鰻方面，荷蘭的病鰻內部臟器的病徵為脾及肝蒼白以及肝臟出血及膽
囊鬱血並伴隨有腹水出現 (Haenen et al., 2002)。台灣的病鰻內部臟器並
無特異性的病徵出現(Chang.et al., 2002)。而在本實驗當中，因為事先已
知採樣的鰻魚場已有皰疹病毒感染，所以第一次於對照組中的脾臟中分離出
病毒來並不意外，推測是因為外在環境改變造成緊迫而造成發病，而之後於
對照組就無病毒再被分離出來。在施打 dxamethasone 的實驗組鰻魚除 4 隻
36
(4/15）鰻魚頭上有水泡樣病變之外，多數鰻魚腹鰭及下顎有點狀出血的發
生，但我們並不認為這是歐洲鰻皰疹病毒所造成的主要病徵。在內部病徵方
面，實驗組及對照組均無特異性病徵出現。
在各臟器分離病毒次數統計當中，脾臟及後腎為分離出病毒最多次數的
臟器，至目前為止並沒有相關的研究可以證明脾臟及後腎與病毒主要增值器
官是否有關聯；在組織病理切片下，可以見到有多發性的黑色素巨噬細胞聚
集於脾臟和後腎的實質部，Chang et al(2002)利用 ISH 證明黑色素巨噬細胞
內有強烈的皰疹病毒訊號；證明黑色素巨噬細胞與皰疹病毒的存在與否有密
切的關係。另外在實驗組中頭部產生水泡病變的鰻魚增生上皮細胞中，在組
織病理切片下可以發現病毒的代謝性包涵體沉積。
於實驗組鰻魚身上分離出的歐洲鰻皰疹病毒，病毒力價均很低，分離出
的病毒其中最高於腎臟，最低於皮膚，分別為 102.55 TCID50/ml 及 101.65
TCID50/ml；雖然沒有研究證明要多少病毒力價才可以造成明顯的病灶或臨床
症狀，但是從本次實驗所的結果得知如此的病毒力價並沒有造成任何潰瘍或
是明顯臨床症狀；是因為溫度不夠或是其他因子所造成的及在幼鰻或成鰻遭
受歐洲鰻皰疹病毒感染後的致病性方面是否有差異則均尚待進一步研究。
鰓也許為皰疹病毒侵入的主要途徑(Haenen O.L.M.et al.,2002），由帶
毒的鰻魚釋放至水中的病毒，經由鰓侵入新寄主而進行感染是目前認為可能
37
的主要的傳播方式之一，另外一種經母鰻傳至子代的垂直感染方式目前尚未
有報告被提出。由本實驗再次證實了台灣的歐洲鰻有皰疹病毒有潛伏感染，
究竟是由國外進口鰻苗帶入或是原本就已經存在於台灣的鰻魚養殖場中，需
做進一步的研究。
Haenen et al(2002)認為最初的歐洲鰻皰疹病毒為野生的鰻魚族群帶進
飼養池內而傳播的而造成其他正常鰻魚的潛伏感染。帶毒的鰻魚由於無臨床
症狀而不易察覺；病毒經由養鰻人員接觸於兩個鰻魚養殖場之間而傳播，或
活鰻經由飛機載運至世界各國販賣或是飼養時，再次感染其他的鰻魚，而使
得被病毒感染的鰻魚數量越來越多；並且因為在無緊迫的條件之下，病毒無
法被分離到，使得預防檢測上更加困難。
促 使 皰 疹 病 毒 再 次 的 由潛 伏 感 染 的寄 主 身 上發 病 主 要 因 子 為 緊 迫
(Van Nieuwstadt et al., 2001, Haenen O.L.M.et al.,2002)，包含外在
因子如，水溫、水的酸鹼度、水的品質及飼養密度等等；及內在因子包含魚
本身的健康狀態、細菌的複合感染、寄生蟲引發的疾病等等。如果可以排除
造成緊迫的因子，就可以減少發病的機會。
由於目前並無疫苗可以應用於臨床，在快速的偵測方式發明之前，本實
驗藉由了解病毒的特性，試著提供一個不適於病毒複製生長的外在調控方
式，來做為預防歐洲鰻皰疹病毒發病及發病後控制的參考。
38
39
第
五
章
參
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獻
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